微生物检测薄膜过滤法操作流程介绍:从滤膜润湿到培养

     薄膜过滤法是微生物限度检测样品前处理的一个重要且普遍使用的方法，相较于平皿法、MPN法，薄膜过滤法能处理大体积样品和含有抑菌成分的样，且菌落截留在滤膜表面，分布均匀、计数直观。但它也对操作有着严格要求：滤膜没润好会导致回收率偏低、冲洗不充分会出现假阴性、贴膜贴反或留气泡整片膜作废、组间灭菌不到位会交叉污染，所以任何一个环节出问题，数据会偏差或整批试验无效。下面我们就按实际操作顺序，介绍从实验准备、供试液制备、滤膜润湿、过滤、冲洗到贴膜培养、计数报告的流程。

1.实验前准备：应当在生物安全柜或超净工作台内操作，台面用 75% 乙醇擦拭消毒。需要配备已灭菌且孔径不大于 0.45μm过滤膜、过滤器、滤杯、带负压调节和真空表的干式抽滤泵、无菌镊子、pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液。滤杯有可重复灭菌型和一次性无菌型两类，样品量大的实验室多用三联/六联多联支架配一次性无菌滤杯，如圣斯特Sciencetool的BV-330-DPF和BV-630-DPF，卡压式快装、每组带独立阀门，换组不互相等待。准备好琼脂培养基，每批使用前做无菌检查和促生长能力检查。常规取 10g 或 10ml 供试品加缓冲液至 100ml 制成 1:10 供试液；含抑菌成分的可加大稀释倍数或加经验证的中和剂；油类样品的滤膜和滤器须预先充分干燥。供试液从制备到接种不超过 1 小时，加热不超过 45℃。

2.滤膜的湿润：药典明确要求水溶性供试液过滤前，先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。这是由于干滤膜接触样品液时不能瞬间均匀铺展，膜面出现干斑，实际有效过滤面积变小，微生物被截留在干湿交界处，回收率下降；干膜与支撑垫片之间也容易残留气泡。向滤杯加入 10～20ml 冲洗液，使其覆盖整个膜面，开负压缓慢抽滤，待液体均匀透膜、无干区无气泡即可，不必抽干，随即加入供试液。一次性滤杯出厂已预装封膜，拆封后直接润湿；用可重复滤器的，装膜时确认滤膜平铺、无褶皱破损。

3.供试液过滤：取相当于 1g、1ml 或 10cm² 供试品的供试液，加适量稀释液混匀后注入滤杯；纯化水、注射用水等低菌量水样取大体积（100ml 或按品种项下规定）直接过滤，靠大体积富集提高检出率。开启抽滤泵后，建议调节负压，使液体以平稳速度透膜。负压过小过滤慢、液体长时间滞留；过大则可能损伤膜面截留的微生物，也易使滤膜变形贴网。BV-330-DPF和BV-630-DPF多联支架的每组通道阀门独立控制，样品凑得齐就同时过滤，凑不齐只开其中几组；先滤完的组关阀泄压、取膜，不必等必须凑满支架滤杯数的样品。

4.滤膜冲洗：这一步是为了洗走截留在膜上的抑菌成分，如防腐剂、抗生素残留。冲洗不充分，膜上的菌等于被"泡"在抑菌物里，培养后长不出来，结果就是假阴性——污染样品被误判合格，这是微生物检验最危险的结果。冲洗液沿滤杯内壁缓缓加入，不要直接冲击膜面，避免冲脱已截留的微生物。还需要分次加入、每次抽干后再加下一次，不要一次性倒满浸泡了事。冲洗量按药典规定每次 100ml、冲洗次数不超过 5 次、总量一般不超过 500ml。还需要同步做阴性对照，取同等体积冲洗液单独过滤一张膜、贴膜培养，阴性对照不得长菌，一旦长菌，说明冲洗液、耗材或环境有污染，本次试验直接无效。

5.取膜与贴膜：用无菌镊子夹取滤膜边缘，菌面朝上平贴到培养基平板上，截留微生物的一面朝向空气，滤膜底面贴合琼脂，营养透过滤膜持续供给膜面微生物。贴反则菌落无法在膜面正常形成，无法计数。贴膜时从滤膜一侧向另一侧缓缓放下，再用镊子背轻压膜面，赶净膜与琼脂之间的气泡；气泡覆盖处微生物得不到营养，会形成空白斑。镊子只夹滤膜边缘，手套、手指、器壁都不要接触膜中央截留区。

6.培养与计数：需氧菌总数贴 TSA 平板，30～35℃ 培养 3～5 天；霉菌和酵母菌总数贴 SDA 平板，20～25℃ 培养 5～7 天。每张滤膜菌落数应不超过 100cfu，超出则减量或提高稀释级重测。无菌落生长以 <1 报告（或 <1 乘以稀释倍数）。阴性对照无菌生长、回收试验正常，结果方为有效。

7.交叉污染的预防： 可重复滤杯每做完一个样品必须重新灭菌。批量检测时，一次性滤杯"一杯一样品、用完即弃较为稳妥，从根源上消除清洗残留和灭菌隐患，BV-330-DPF和BV-630-DPF都配备的是一次性已灭菌的塑料滤杯，即拆即用。多联支架的不锈钢基座和滤膜支撑片会接触滤液，更换样品时可用配套的手持式火焰灭菌枪对支撑片、滤头快速灼烧灭菌，再进行下一组。

8，预防液体倒吸进抽滤泵：倒吸多发生在废液瓶过满、关机顺序错误时。圣斯特的多联过滤系统设备层面均有三道防护：集液瓶抽气口浮球逆止阀（液满自动关闭）、管路中的疏水阻水保护器、泵进气端带滤芯的缓冲杯。操作上注意废液瓶及时排液，带底部排液口的集液瓶松开管夹即可快速导出，别等液满报警才处理。